Muutettu gradienttigeelielektroforeesi

Periaate

Kaksijuosteiset DNA-molekyylit Yleisessä polyakryyliamidigeelielektroforeesissa sen migraatiokäyttäytyminen määräytyy sen molekyylikoon ja varauksen mukaan. Eripituisia DNA-fragmentteja voidaan erottaa, mutta samanpituinen DNA-fragmentti on sama kuin liiman migraatiokäyttäytyminen, joten sitä ei voida erottaa. DGE/TGGE-teknologiaa lisätään yleiseen polyakryyliamidigeeliin, joka lisätään denaturoivan aineen (urea ja formamidi) gradienttiin, jolloin erotetaan samanpituinen, mutta sekvenssistä eri DNA-fragmentti erotetaan. Tietyllä DNA-fragmentilla on ainutlaatuinen sekvenssi, sen sekvenssikoostumus määrittää sen lukituksen avaavan domeenin, MD) ja sulamiskäyttäytymisen. Muutamassa sadassa emäsparissa DNA-fragmentteja on tyypillisesti useita paikantamattomia alueita, joista jokaisessa on jatkuva emäspari (kuvio 1). Kun astekonsentraatio lisää vähitellen alinta liuosalueen pitoisuuttaan, tämän alueen segmentti altistetaan uudelleen emäsparille. Nämä alueet ovat peräkkäin restriktio, kun toistensa hajoamisalueen pitoisuus saavutetaan peräkkäin. Kunnes degeneratiivinen pitoisuus saavutti suurimman liuoksen korkeimpaan liuosalueen konsentraatioon, myös korkein wc-alue ratkaisee ketjun, mikä ratkaisee kaksijuosteisen DNA:n kokonaan.

Erilainen kaksijuosteinen DNA-fragmentti

Eri kaksijuosteiset DNA-fragmentit ovat erilaisia ​​sekvenssikoostumuksensa vuoksi, joten epätavanomaisen vyöhykkeen lukituksen avaava alue ja jokainen hajoamisalue ovat erilaisia. /. Kun he suorittavat DGGE:n, tiheysagenssin aste on suhteellisen pieni, eikä kaksijuosteisen DNA-fragmentin vähimmäisdesimaalialuetta voida tehdä, ja DNA-fragmentin migraatiokäyttäytyminen on samalla tavalla kuin yleisessä polyakryyliamidigeelissä. Kuitenkin, kun denaturoiva pitoisuus saavuttaa DNA-fragmentin korkeimman liuosalueen lämpötilan, DNA-fragmentista tulee täysin yksijuosteinen DNA-molekyyli, ja ne voivat jatkaa kulkemista liimassa. Siksi, jos eri DNA-fragmenttien välinen sekvenssiero esiintyy korkeimmalla liuosalueella, näitä segmenttejä ei voida erottaa. Tämä ongelma voidaan ratkaista lisäämällä GC-rikas DNA-fragmentti (GC-leike, yleensä 30-50 emäsparia) DNA-fragmentin toiseen päähän. Korkein GC-leikkeen DNA-fragmentin sisältävä liuosalue on GC-leikkeen sekvenssissä, sen liuospitoisuus on korkea ja DNA-fragmentin täydellinen hajoaminen DGGE-kumissa voidaan estää. Kun GC-leike lisätään, DNA-fragmentin sekvenssierot voidaan hylätä. Kuitenkin, kun DNA-fragmentti siirtyy tiettyyn paikkaan, degeneraattorikonsentraatio on vain kaksijuosteisen DNA-fragmentin pienimmän hajoamisalueen väheneminen, ja kaksijuosteisen DNA-fragmentin pienin liuosalue tapahtuu välittömästi. DNA-fragmentin migraationopeus osittain hajonneen DNA-fragmentin osassa laskee jyrkästi. Siksi samanpituiset sekvenssin DNA-fragmentit saavuttavat vastaavien vähimmäislukitusalueiden liuospitoisuuden eri kohdissa liimassa, joten niillä on osittain pienenevä ketju eri kohdissa liimassa. Liima erottuu.

ominaisuudet

DGGE / TGGE:tä on käytetty laajalti bakteeri-, sinibakteeri-, bakteeri-, mikroeukaryootti-, eukaryootti- ja virusyhteisön biologisen monimuotoisuuden analysointiin luonnollisissa ympäristöissä [8]. Tämä tekniikka voi tarjota hyödyllistä tyyppitietoa yhteisöissä ja analysoida samanaikaisesti useita näytteitä, joilla on toistettavan ja helpon toiminnan ominaisuudet, jotka soveltuvat populaatioiden spatiaalisten muutosten kartoittamiseen ja voivat hybridisoitua tiettyihin koettimiin sekvenssianalyysin avulla tai erityisten koettimien kanssa. sävellys. DGGE:llä ja TGGE:llä on vastaavasti sama pituus ja sama pituus, mutta vain yksi DNA-fragmentin emäsfragmentti erotetaan asteittain lisääntyvän kemiallisen rappeuttavan gradientin ja lineaarisen lämpötilagradientin avulla. DNA-molekyylit erotetaan tietyssä lämpötilassa komplementaarisen ketjun vetysidossisällöstä (jossa on runsaasti GC:n alueellista sulamislämpötilaa) ja viereisen emäksen painovoimasta riippuen.

DGGE-menetelmä

Edut

1, melkein kaikki mutaatiot

2 voidaan havaita ja mutanttimolekyylit voivat olla ehjiä. Maata kantavat molekyylit analysoidaan erikseen lisäanalyysiä varten

3, ei tarvitse merkitä

4, vain yksi vaihe elektroforeesissa

5, voidaan käyttää ilman monistettua genomista DNA:ta

6 voi havaita DNA-muunnoksia

metyloinnin haittapuoli

2, on tarpeen suorittaa esikokeet vaativat kalliin "GC-lastan"

3, joka ei voi määrittää mutaatiota DNA-fragmentin asemassa

4, sinun on käytettävä Gradient-geeliä, joka sisältää myrkyllistä formamidia

Kuviossa 5 DNA-fragmentin kokoraja on rajoitettu 100-500 emäspariin