Změněná gradientová gelová elektroforéza

Zásada

Dvouřetězcové molekuly DNA Při obecné elektroforéze na polyakrylamidovém gelu je její migrační chování určeno její molekulovou velikostí a nábojem. Lze rozlišit různě dlouhé fragmenty DNA, ale stejně dlouhý fragment DNA je stejný jako migrační chování v lepidle, takže jej nelze rozlišit. Technologie DGE / TGGE je přidána k obecnému polyakrylamidovému gelu, který je přidán do gradientu denaturačního činidla (močovina a formamid), čímž se rozliší stejná délka, ale je oddělen sekvenčně odlišný fragment DNA. Konkrétní fragment DNA má svou jedinečnou sekvenci, složení sekvence určuje jeho odemykací doménu, MD) a chování při tání. Několik set párů bází fragmentů DNA má typicky několik nelokalizovaných oblastí, z nichž každá má spojitý pár bází (obr. 1). Když koncentrace ve stupních postupně zvyšuje svou nejnižší koncentraci oblasti roztoku, segment této oblasti je vystaven obnovenému páru bází. Tyto oblasti jsou postupně omezovány, když je postupně dosaženo koncentrace každé další oblasti rozpadu. Dokud degenerativní koncentrace nedosáhla nejvyšší koncentrace roztoku k nejvyšší koncentraci oblasti roztoku, nejvyšší oblast toalety také rozloží řetězec, čímž zcela vyřeší dvouvláknovou DNA.

Odlišný fragment dvouvláknové DNA

Různé dvouřetězcové fragmenty DNA se liší kvůli svému sekvenčnímu složení, takže odemykací oblast nekonvenční zóny a každá z každé z oblastí rozkladu jsou odlišné. z. Když provádějí DGGE, je stupeň hustoty činidla relativně malý a nelze vytvořit minimální desetinnou oblast dvouřetězcového fragmentu DNA a migrační chování fragmentu DNA je stejné jako v obecném polyakrylamidovém gelu. Jakmile však denaturační koncentrace dosáhne nejvyšší teploty oblasti roztoku fragmentu DNA, fragment DNA je zcela vyřešen, aby se stal jednořetězcovou molekulou DNA, a mohou pokračovat v migraci v lepidle. Pokud se tedy sekvenční rozdíl mezi různými fragmenty DNA objeví v nejvyšší oblasti roztoku, nelze tyto segmenty rozlišit. Tento problém lze vyřešit přidáním fragmentu DNA bohatého na GC (GC klip, obecně 30-50 párů bází) na jeden konec fragmentu DNA. Nejvyšší oblast roztoku obsahující fragment DNA GC klipu je v sekvenci GC klipu, jeho koncentrace roztoku je vysoká a fragmentu DNA lze zabránit v úplném rozlišení v kaučuku DGGE. Když je přidán GC klip, mohou být sekvenční rozdíly ve fragmentu DNA odstraněny. Jakmile však fragment DNA migruje do specifické polohy, koncentrace degenerátoru je pouze poklesem v poklesu minimální oblasti rozpadu dvouřetězcového fragmentu DNA a okamžitě nastane minimální oblast roztoku dvouřetězcového fragmentu DNA. Rychlost migrace fragmentu DNA v části částečně rozloženého fragmentu DNA se prudce sníží. Proto stejně dlouhé, fragmenty DNA sekvence, dosáhnou koncentrace roztoku příslušných minimálních odblokovacích oblastí na různých místech v lepidle, takže budou mít částečně klesající řetězec na různých místech lepidla. Lepidlo se rozlišuje.

Funkce

DGGE / TGGE se široce používá k analýze biodiverzity bakteriálních, modrých bakterií, bakterií, mikroeukaryotických, eukaryotických a virových komunit v přirozeném prostředí [8]. Tato technologie může poskytovat výhodné typové informace v komunitách a současně analyzovat více vzorků, které mají vlastnosti opakovatelného a snadného provozu, vhodné pro průzkum prostorových změn v populacích a mohou se hybridizovat se specifickými sondami sekvenční analýzou nebo se specifickými sondami Analýza identifikace komunita složení. DGGE a TGGE mají stejnou délku a stejnou délku, ale pouze jeden fragment báze fragmentu DNA je oddělen postupně se zvyšujícím chemickým degenerativním gradientem a lineárním teplotním gradientem. Molekuly DNA se oddělují při určité teplotě v závislosti na obsahu vodíkových vazeb v komplementárním řetězci (bohatém na regionální teplotu tání GC) a na gravitaci přilehlé báze.

Metoda DGGE

Výhody

1, téměř všechny mutace

2 lze detekovat a mutantní molekuly mohou být neporušené Molekuly nesoucí Zemi jsou samostatně analyzovány pro další analýzu

3, není třeba označovat

4, pouze jeden krok v elektroforéze

5, lze použít bez amplifikované genomové DNA

6 dokáže detekovat modifikace DNA

nevýhoda methylace

2, je nutné provést předexperimenty vyžadují drahou "GC dlahu"

3, který nedokáže určit mutaci v pozici fragmentu DNA

4, musíte použít Gradient gel obsahující toxickou látku formamid

5, limit velikosti fragmentu DNA je omezen na 100-500 bp