Променена градиентна гел електрофореза

Принцип

Двойноверижни ДНК молекули При обща електрофореза с полиакриламиден гел миграционното му поведение се определя от неговия молекулен размер и заряд. ДНК фрагменти с различна дължина могат да бъдат разграничени, но ДНК фрагментът със същата дължина е същият като миграционното поведение в лепилото, така че не може да бъде разграничен. Технологията DGE / TGGE се добавя към общия полиакриламиден гел, който се добавя към градиента на денатуриращия агент (урея и формамид), като по този начин се разграничава една и съща дължина, но последователността се разделя на различен ДНК фрагмент. Конкретен ДНК фрагмент има своя уникална последователност, съставът на неговата последователност определя неговия отключващ домейн, MD) и поведение при топене. Няколкостотин базови двойки от ДНК фрагменти обикновено имат няколко нелокализирани области, всяка от които има непрекъсната базова двойка (фиг. 1). Когато градусовата концентрация постепенно увеличава най-ниската си концентрация на област на разтвора, сегментът от тази област се подлага на възобновена базова двойка. Тези региони са последователно ограничени, когато концентрацията на всеки друг регион на разпадане е последователно достигната. Докато дегенеративната концентрация достигне най-високия разтвор до най-високата концентрация на разтворения регион, най-високата зона на тоалетната също разгражда веригата, като по този начин напълно разтваря двойноверижната ДНК.

Различен двойноверижен ДНК фрагмент

Различните двойноверижни ДНК фрагменти са различни поради състава на тяхната последователност, така че отключващият регион на неконвенционалната зона и всяка от зоните на разлагане са различни. на. Когато извършват DGGE, степента на агента за плътност е относително малка и минималната десетична област на двойноверижния ДНК фрагмент не може да бъде направена и миграционното поведение на ДНК фрагмента е по същия начин, както в общия полиакриламиден гел. Въпреки това, след като денатуриращата концентрация достигне най-високата температура на разтвора на ДНК фрагмента, ДНК фрагментът е напълно разтворен, за да се превърне в едноверижна ДНК молекула и те могат да продължат да мигрират в лепилото. Следователно, ако разликата в последователността между различните ДНК фрагменти се появява в най-високата област на разтвора, тези сегменти не могат да бъдат разграничени. Този проблем може да бъде решен чрез добавяне на богат на GC ДНК фрагмент (GC клипс, общо 30-50 базови двойки) в единия край на ДНК фрагмента. Най-високата площ на разтвора, съдържаща ДНК фрагмента на GC скобата, е в последователността на GC скобата, концентрацията на разтвора е висока и ДНК фрагментът може да бъде предотвратен от пълно разтваряне в DGGE каучук. Когато се добави GC клип, разликите в последователностите в ДНК фрагмента могат да бъдат отхвърлени. Обаче, след като ДНК фрагментът мигрира до определена позиция, концентрацията на дегенератора е само намаляването на минималната област на разпадане на двойноверижния ДНК фрагмент и незабавно възниква минималната област на разтвора на двойноверижния ДНК фрагмент. Скоростта на миграция на ДНК фрагмента в част от частично разградения ДНК фрагмент рязко ще намалее. Следователно една и съща дължина, ДНК фрагменти от последователността ще достигнат концентрацията на разтвора на съответните минимални отключващи региони на различни места в лепилото, така че те ще имат частично намаляваща верига на различни места в лепилото. Лепилото се отличава.

Характеристика

DGGE / TGGE се използва широко за анализ на биоразнообразието на бактериални, сини бактерии, бактерии, микроеукариотни, еукариотни и вирусни общности в естествена среда [8]. Тази технология може да предостави полезна информация за типа в общности и едновременно да анализира множество проби, които имат характеристиките на повторяема и лесна работа, подходящи за изследване на пространствени промени в популациите и могат да хибридизират към специфични сонди чрез анализ на последователността или със специфични сонди Общност за идентификация на анализа състав. DGGE и TGGE съответно имат еднаква дължина на същата дължина, но само един основен фрагмент от ДНК фрагмента е разделен от постепенно увеличаващия се химически дегенеративен градиент и линейния температурен градиент. ДНК молекулите се разделят при определена температура, в зависимост от съдържанието на водородна връзка на комплементарната верига (богата на регионална температура на топене на GC) и гравитацията на съседната основа.

DGGE метод

Предимства

1, почти всички мутации

2 могат да бъдат открити и мутантните молекули могат да бъдат непокътнати Молекулите, носещи Земята, се анализират отделно за допълнителен анализ

3, няма нужда да маркирате

4, само една стъпка в електрофорезата

5, може да се използва без амплифицирана геномна ДНК

6 може да открие модификации на ДНК

недостатък на метилирането

2, необходимо е да се извършат предварителни експерименти изискват скъпа "GC шина"

3, който не може да определи мутацията в позицията на ДНК фрагмента

4, трябва да използвате градиентен гел, съдържащ токсично вещество формамид

5, границата на размера на ДНК фрагмента е ограничена до 100-500 bp